人体卵母细胞冷冻保存

简介

人体卵母细胞冷冻保存或“卵冷冻”长期以来一直是困扰低温生物学家的一个难题。虽然人类在几十年前便已成功冷冻精子或胚胎(受精卵)，然后进行解冻并孕育健康的孩子，但是，卵子冷冻是在近些年来才取得成功的技术。人体卵母细胞冷冻保存使人类获益良多，尤其是它保护了女性的生育能力。卵母细胞储存的有益之处包括：(i) 让由于身患癌症而可能丧失生育能力的女性在进行放疗或化疗或卵巢切除术之前保存她们的卵母细胞;(ii) 在没有可用精子时保护体外受精 (VIF) 周期;(iii) 减少胚胎储存产生的宗教和伦理问题;(iv) 消除供受者同步问题;(v) 使捐赠的卵母细胞与捐赠的精液具有相似的“检疫期”;(vi) 推迟女性的生育年龄，同时使她们拥有更多的生育机会。

背景　　

细胞冷冻保存的理论基础于1965 年首次提出 (Mazur, 1965)。直到 1972 年才有世界上第一批小鼠从冷冻保存的胚胎中降生 (Whittingham et al., 1972)，此前这些理论一直没有得到试验的验证。1976 年，世界上第一只由冻融卵母细胞发育而成的小鼠获得成功 (Parkening et al., 1976)。近年来，有大量文献报告，现今已有至少22 种其他哺乳动物物种成功从冷冻保存的卵母细胞降生 (Rall, 2001; Leibo et al., 2002)。上世　　纪 80 年代初期，有报告称，人类首次孕育冷冻保存的人体胚胎 (Trounson et al., 1983) 并成功降生婴儿 (Zeilmaker et al., 1984)。现在，人体胚胎的冷冻和储存已经成为全世界体外受精(IVF) 实验室的行业临床标准 (Shaw et al., 1993)。CDC 网站的资料显示，仅2001 年就有5,047 名孩子降生于冻融人体胚胎(Wright et al., 2004)。

卵母细胞冷冻保存　　

1986 年首次报告了人类孕育冻融人体卵母细胞 (Chen, 1986)。但是直到近些年来，冷冻卵母细胞的技术仍然进展缓慢，并且仅有几例婴儿成功降生的报告 (Al-Hasani et al., 1987; Van Uem et al., 1987; Chen, 1988)。其原因主要有两个：与新鲜的卵母细胞相比，冷冻保存的卵母细胞发生染色体异常的几率更高 (Johnson et al., 1987; Pickering et al., 1987; Sathananthan et al., 1988)，以及，“透明带硬化”导致受精率低 (Vincent et al., 1990; Wood et al., 1992; George et al., 1993)。上世纪90 年代，随着卵母细胞冷冻保存后用于协助成功受精的卵胞浆内单精子注射 (ICSI) 技术的发展，卵母细胞的冷冻保存取得了重大进展(Gook et al., 1995; Kazem et al.,1995)。随后进行的研究表明，卵母细胞的冷冻保存并不像人们之前认为的那样是有害的 (Gook et al., 1993, 1994)。截至 2000 年，已有超过20 名正常孩子由冻融卵母细胞降生 (Tucker et al.,1996, 1998; Porcu et al.,1997, 1998, 1999a,b; Antinori et al., 1998; Borini et al., 1998; Nawroth et al.,1998; Polk de Fried et al.,1998; Vidali et al., 1998; Yang et al., 1998, 1999; Young et al., 1998; Porcu,1999)。截至目前，约有 100 名孩子是借助卵母细　　胞冷冻技术降生的 (Leibo, 2003; Stachecki et al., 2004)。

当前的方法　　

慢速冷冻

慢速冷冻是报告最多的一种卵母细胞冷冻保存方法，也是世界上绝大多数婴儿成功降生的一种方法。慢速冷冻法是将Willadsen (1977) 首次提出的绵羊和牛胚胎冷冻步骤稍作修改后提出的。其中，各种研究方法中最常见的变化为平衡时间和渗透防冷冻添加剂 (CPA) 的用量以及蔗糖浓度 (Fabbri et al., 2001)。

近年来，慢速冷冻开始使用低钠或无钠溶液 (Azambuja et al., 2002; Quintans et al., 2002; Boldt et al., 2003)。但是，基本的原理仍保持不变。将卵母细胞悬浮在含有 CPA 的溶液中，随着该溶液以 0.3 /分的速度进行缓慢冷却并最终达到 -30 或以下，卵母细胞逐渐冷却，选择合适的植冰点并促进卵母细胞脱水。最后，将卵母细胞投入液氮溶液中储存。

超快速冷冻(玻璃化)

玻璃化或达到一种玻璃状的状态是慢速冷冻的一种潜在替代方法 (1985 年首次提出 (Rall et al., 1985))。因为卵母细胞是否发生冷冻损伤与时间有关，所以该方法的基本原理是，以足够快的速度进行冷冻，使细胞内的水在发生结晶前凝固，防止结冰的发生以及对卵母细胞造成损伤 (Martino et al., 1996)。实现这一基本原理的方法是，将细胞置于高浓度的 CPA 溶液经过极短的平衡时间，然后将其投入液氮溶液中进行超快速冷却。高渗透玻璃化溶液迅速将细胞脱水，并且细胞浸没在液氮溶液中迅速凝固，细胞内的水不会形成有害的冰晶。但是这项技术有两个重要的问题，即：室温下高浓度的 CPA 的毒性随之增高 (Shaw et al., 1992)，以及冷冻和解冻的速度不足无法避免结晶的形成和反玻璃化的发生 (Vajta et al., 1998)。几年来有几篇报告介绍了他们克服上述问题的能力，最终使玻璃化卵母细胞孕育出健康的孩子 (Kuleshova et al., 1999; Kuwayama et al., 2000; Yoon et al., 2000, 2003; Katayama et al., 2003)。

有效性研究　　

过去九年，据 20 多篇文章和摘要的介绍，已有 5,000 多个人体卵母细胞进行了冷冻保存，并有 100 余个新生儿诞生于冷冻保存的卵母细胞(综述总结：Leibo, 2004; Stachecki et al., 2004)。但是，这些数据过于保守，有证据显示，目前已有 200 余位健康的新生儿诞生于冷冻的卵母细胞。由报告推断，卵母细胞平均存活率、受精率和临床怀孕率的估计值分别为 54%、61% 和 35% (Kazem et al., 1995; Gook et al., 　　1995; Tucker et al., 1996, 1998; Porcu et al., 1997, 1999, 2000; Polak de Fried et al., 1998; Young et al., 1998; Kulehova et al., 1999; Hong et al., 1999; Yoon et al., 2000, 2003; Fabbri et al., 2001; Winslow et al., 2001; Yang et al., 2002; Boldt et al., 2003;Katayama et al., 2003; Fosas et al., 2003; Borini et al., 2004).2005 年 5 月，人权委员会 (HRC) 在年度太平洋海岸生殖协会 (Pacic Coast Reproductive Society) 上的一份摘要介绍，人体卵母细胞的存活率和受精率分别高达 79% 和 81%。背面续另外，2005 年 6 月，Porcu 在欧洲人类生殖与胚胎协会(ESHRE) 上介绍了他在进行 500 多次试验后得出的结论。他最终得出的结果表明，冷冻保存的卵母细胞的受孕成功率与冷冻保存的胚胎的受孕成功率十分接近。　

HRC Fertility 卵母细胞冷冻保存计划　　

HRC Fertility 是一种医疗实践，致力于进一步发展对卵母细胞冷冻保存的研究，并为那些由于癌症、年龄或其他医疗状况的原因而需要保护其生育能力的女性提供服务。

经验与创新

HRC 与美国五家高级医疗中心合作，包括斯坦福大学的生殖内分泌与不孕症计划 (Stanford University’s Reproductive Endocrinology and Infertility program)(加利福尼亚州北部)、纽约生殖医学协会 (Reproductive Medicine Associates of New York)(纽约州)、新泽西州试管婴儿 (IVF New Jersey)(新泽西州)、生殖科学中心 (Reproductive Science Center)(马萨诸塞州)和德克萨斯州生育中心 (Texas Fertility Center)(德克萨斯州)，通过多中心临床试验进一步研究卵母细胞的冷冻保存。HRC 提供了最先进的技术，为有意向的女性冷冻保存卵母细胞。现在已经采用 IRB 研究方法来不断研究冷冻保存卵母细胞的新技术。任何年龄在 38 岁以下的女性均可进行筛查，确定其是否可以进行卵母细胞冷冻保存，以供将来生育之用。